Cell Rep Med︱苏文如/王祥珪团队揭示甲状腺相关眼病眼眶组织单细胞水平免疫微环境

撰文︱李钊淮

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

甲状腺相关性眼病（thyroid-associated ophthalmopathy，TAO）是一种影响眼眶和眼附属器的自身免疫性疾病，可能导致眼眶畸形、复视，甚至视力丧失，是甲状腺疾病最常见的甲状腺外表现之一[1]。TAO涉及的主要过程是眶周组织中的炎症、糖胺聚糖积累、脂肪生成和肌纤维形成。由于对其发病机制的了解不足，TAO的治疗仍十分具有挑战性。糖皮质激素及免疫抑制剂是减轻炎症的主要治疗方法，但成功率有限且副作用很多、停药后经常复发，通常需要手术去解决视力风险或恢复正常的眼眶解剖结构[2]。目前的研究主要集中于CD4+T细胞和眼眶成纤维细胞（orbital fibroblast，OF）在TAO中的作用，而其他细胞类型是否参与TAO和分子监视在很大程度上是未知的。因此，深入解析TAO眼眶结缔组织的免疫微环境，有望为进一步阐明TAO发病机制和潜在的治疗靶点。

中山大学中山眼科中心苏文如教授团队一直聚焦于葡萄膜炎等各种眼免疫性疾病的免疫学机制和临床转化研究，其系列研究成果极大推动了葡萄膜炎及自身免疫性疾病领域进展。基于在眼免疫学和单细胞领域的系统性研究成果，2022年7月26日，中山大学中山眼科中心的苏文如教授和中南大学湘雅医院王祥珪教授合作开展研究，作为共同通讯作者在Cell子刊Cell Report Medicine上发表了题为“Single-cell RNA Sequencing Depicts the Local Cell Landscape in Thyroid-associated Ophthalmopathy”的研究论文。该研究通过对接受眶减压手术的TAO患者与接受眼睑整形术的正常对照的眼眶结缔组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。该研究建立了TAO眼眶结缔组织的高通量单细胞图谱，系统阐述了眼眶组织中不同基质细胞及免疫细胞的表型、转录水平的变化，通过细胞亚群、差异基因分析、细胞间相互作用分析等，在单细胞层面绘制了TAO的眼眶结缔组织免疫微环境图谱，为理解TAO患者眼眶炎症的病理特点以及开发新型干预措施提供重要思路。（拓展阅读：苏文如课题组最新研究成果，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：Fundamental Research︱苏文如/王祥珪团队揭示人类怀孕过程中外周血免疫单细胞水平动态变化；STAR Protocols︱苏文如/郑颖丰团队发表基于高维质谱流式的人类血液免疫细胞功能分析的实验方案）

分析结果表明，眼眶结缔组织可以分为成纤维细胞，内皮细胞，周细胞，B细胞，T细胞，中性粒细胞和单核细胞等髓系细胞。相比于正常对照，TAO眼眶组织表现为明显的炎性细胞浸润，免疫细胞在TAO眼眶组织中比例增加（图1）。

图1 眼眶结缔组织细胞类型

（图源：Li Z, et al., Cell Report Medicine. 2022）

接下来对TAO发病的核心细胞类型——成纤维细胞（OF）进行单独分析发现，表达RASD1的成纤维细胞亚群——成脂纤维细胞（lipofibroblast，LPF）高度表达成脂相关的转录因子如PPARG，CABPB和PLIN2等，并且还高度表达趋化因子和炎性细胞因子[3]。成纤维细胞通过趋化因子吸引炎性细胞在眼眶组织的浸润，并且其还具有分化为脂肪细胞的潜能。炎性细胞浸润和炎性因子的分泌是成纤维细胞激活的主要原因，而脂肪细胞增生则可以导致TAO患者突眼的出现。拟时序研究同样发现，在TAO中OF往LPF方向分化增多（图2），表明这群细胞高度参与了TAO的发病过程。上述发现揭示了LPF的潜在marker以及成纤维细胞亚群的转录变化和特点。

图2 眼眶成纤维细胞分析

（图源：Li Z, et al., Cell Report Medicine. 2022）

对其他细胞类型进行分析发现，表达非典型趋化因子受体1（Atypical Chemokine Receptor 1，ACKR1）的内皮细胞在TAO中明显增加，且高度表达黏附分子、选择素及趋化因子。进一步功能分析表明ACKR1+内皮细胞在免疫细胞浸润的过程中发挥了重要作用。因此研究人员提出，ACKR1+内皮细胞可能也参与了TAO的发病过程（图3）。

图3 眼眶内皮细胞分析

（图源：Li Z, et al., Cell Report Medicine. 2022）

干扰素IFNG可以刺激成纤维细胞激活，分泌趋化因子和炎症因子，进一步增殖分化，导致TAO的病理改变[4]。分析发现，眼眶IFNG除了传统认为的CD4+T细胞来源，CD8+细胞毒T细胞（CTL）也是重要来源。进一步研究发现CD8+CTL则表现为终末分化表型[5]，高表达CD57及CX3CR1，同时还高表达颗粒酶和穿孔素。终末分化T细胞仍然能够较长时间的保持其功能[5]。因此， CD8+CTL可能是TAO中干扰素的持续来源之一。此外，在眼眶组织中还发现了一群脂肪组织巨噬细胞（adipose tissue macrophage，ATM）。ATM的典型表现是表达Ⅱ型巨噬细胞标记CD163、CD206，又具有Ⅰ型巨噬细胞的炎症分泌功能（IL-1β、CCL2、CCL3等），同时还高表达脂肪酸转运蛋白CD36[6，7]。ATM是在糖尿病和肥胖患者的脂肪组织中首次发现的，其炎症分泌功能是导致脂肪组织炎症反应及胰岛素抵抗的原因之一[6]。因此，ATM可能也参与了TAO眼眶脂肪组织的炎症反应及增生(图4)。

图4 眼眶免疫细胞分析

（图源：Li Z, et al., Cell Report Medicine. 2022）

图5 文章模式图：TAO眼眶结缔组织免疫微环境

（图源：Li Z, et al., Cell Report Medicine. 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上，这项工作扩展了我们对于甲状腺相关性眼病（TAO）眼眶组织免疫微环境的认识，加深了人们对TAO病理变化过程中复杂免疫机制的理解。研究者对接受眶减压手术的TAO患者与接受眼睑整形术的正常对照的眼眶结缔组织进行单细胞RNA测序，以阐明眼眶结缔组织的免疫变化。TAO眼眶组织呈现明显的炎性浸润表现，单细胞水平分辨率使研究者得以全面分析眼眶组织浸润的各种免疫细胞、基质细胞转录组变化及细胞间相互作用。研究发现成脂分化成纤维细胞亚群的潜在marker，首次提出ACKR1内皮细胞和脂肪组织巨噬细胞参与了TAO的发病过程。与此同时作为补充，终末分化CD8细胞毒T细胞也是眼眶组织干扰素的分泌来源之一。该研究拓展了人们对TAO发病过程的认识，期待后续的研究在更多样化的疾病条件下，允许在病程长度、干预措施(全身类固醇或放疗)，甚至解剖特征(以眼外脂肪膨胀或纤维化为主)方面进行比较。进一步的实验可以通过在更大的队列中进行蛋白质分析来评估上述转录变化，从而丰富我们的研究。

原文链接：https://www.cell.com/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791(22)00235-X

中山大学中山眼科中心苏文如教授，中南大学湘雅医院王祥珪教授为共同通讯作者。中山大学中山眼科中心研究生李钊淮、中山大学附属孙逸仙纪念医院王梅教授、中南大学湘雅医院谭佳教授、中山大学中山眼科中心研究生朱蕾、中山大学附属孙逸仙纪念医院曾鹏医生、中南大学湘雅医院陈晓珍为共同第一作者。该项目研究得到国家自然科学基金优秀青年项目的支持。

通讯作者：苏文如

（照片提供自：中山大学中山眼科中心苏文如团队）

通讯作者简介：

苏文如，主任医师，博士研究生导师。“国家优青”基金获得者，“广东省杰青”基金获得者，临床上擅长葡萄膜炎等各种眼免疫性疾病和眼底疾病的诊断和治疗。主持国自然优秀青年基金，国家重点研发计划课题等多项国家级基金。目前主要研究方向为眼科免疫炎症性疾病的基础及临床研究，近年来在 PNAS, Cell reports medicine, Cell Discovery, Cell Death Differ, J Allergy Clin Immunol等Sci杂志发表80余篇学术论文。获广东省科技进步一等奖1项，授权发明专利3项。如有兴趣申请苏教授课题组博士后，请发Email至：[e-mail]。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Bahn R.S. (2010). Graves' ophthalmopathy. The New England journal of medicine 362, 726-38.

[2] Wiersinga W.M. (2017). Advances in treatment of active, moderate-to-severe Graves' ophthalmopathy. The lancet. Diabetes & endocrinology 5, 134-142.

[3] Orr S.K., Butler K.L., Hayden D., Tompkins R.G., Serhan C.N., and Irimia D. (2015). Gene expression of proresolving lipid mediator pathways is associated with clinical outcomes in trauma patients. Crit. Care Med. 43, 2642-50.

[4] Bacheta D., Miśkiewicz P., Głuszko A., Nowicka G., Struga M., Kantor I., Poślednik K.B., Mirza S., and Szczepański M.J. (2019). Immunological aspects of graves' ophthalmopathy. Biomed Res. Int. 2019, 7453260.6

[5] Kared H., Martelli S., Ng T.P., Pender S.L.F., and Larbi A. (2016). CD57 in human natural killer cells and T-lymphocytes. Cancer Immunology, Immunotherapy 65, 441-452.

[6] Lumeng C.N., Bodzin J.L., and Saltiel A.R. (2007). Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. The Journal of clinical investigation 117, 175-84.

[7] Silverstein RL, Febbraio M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Sci Signal. 2009;2(72):re3.

本文完